伤口愈合实验-干细胞侵袭

伤口愈合实验是体外研究细胞迁移的的一个有用的实验。原理是人为的在铺板的单层细胞中制造一个空白的无细胞的地带，然后对这个无细胞地带的边缘的细胞进行观察；这些边缘的细胞会开始进行迁移活动，并且终覆盖整个无细胞的区域，重新互相接触在一起。法国的科研人员在2015年的 STEM CELL上发的文章中提出神经生长因子（NGF）和神经生长因子前体（proNGF）会自动的激活乳腺癌干细胞，并且发生侵袭。文中，使用乳腺癌细胞系和肿瘤分离的细胞进行伤口愈合实验，得出，由NGF处理的肿瘤离的乳腺癌细胞的伤口愈合速率有非常显著的提高。说明在NGF能促进乳腺癌细胞迁移活动。

Nerve Growth Factor and proNGF Simultaneously Promote Symmetric Self-Renewal, Quiescence, and Epithelial to Mesenchymal Transition to Enlarge the Breast Cancer Stem Cell Compartment

E. Tomellini, Y. Touil, C. Lagadec, S. Julien, P. Ostyn, N. Ziental-Gelus, S. Meignan, J. Lengrand, E. Adriaenssens, R. Polakowska and X. Le Bourhis

STEM CELLS, 2015, 10.1002/stem.1849

在文中，使用Ibidi开发的伤口愈合插件进行了伤口愈合实验。这是一种双孔的硅胶插件，可以放在培养皿中，插件两孔间的孔壁宽度为500μm。将细胞种在插件中，等待细胞贴壁长满后，将插件移除，这样，两孔间的缝隙就是一个无细胞的“划痕”。

1. 实验材料

• 细胞:     MCF-7 、肿瘤分离细胞
• 实验耗材:   伤口愈合插件培养皿 (ibidi, 81176) 
• 细胞培养基:  MEM medium
• 试剂:  EGF  （sigma， E9644）

           bFGF （R&D，233-FB）

           NGF  （Scil Protein）

           proNGF （Alomone Labs，N-285）

• 灭菌镊子

1. 实验步骤

1. 铺细胞（图三）

• 将ibidi伤口愈合培养皿底部的保护胶带撕除。
• 在ibidi细胞插件的每孔中加入1 × 104的细胞悬液。注意不要大力晃动培养皿。以防止细胞不均匀。
• 在37。C培养箱中孵育24小时。

图三：A. 去除培养皿底部的保护胶带。B.C.在ibidi伤口愈合插件中加入细胞。

1. 形成“划痕”

• 采用无血清MEM培养基培养细胞4小时
• 如图四所示，小心的用镊子夹住插件的一个角，将插件移除。 

• 移除插件后，要用显微镜检查是否形成合格的“划痕”。
• 小心的清洗细胞，之后加入2ml培养基进行培养（图五）。

1. 采集并分析图像

• 在显微镜下选取能同时看到“划痕”和两边细胞的视野进行成像，“划痕”的方向好是水平或者垂直。
• 采集0h和4h的图像，并且分析每张图的细胞覆盖划痕区的面积。

（三）实验结果

如图所示，ML表示MCF-7 细胞系。肿瘤分离细胞团分别由EGF、bFGF、NGF和proNGF处理，由t-EGF/bFGF、t-NGF、t-proNGF表示。可以看到由NGF处理的细胞，在4h的时候覆盖面积大，迁移速率快。