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ibidi免疫荧光实验|可移除腔室载玻片对细胞的培养固定染色

更新时间:2023-05-22   更新时间:2023-05-22   点击次数:773次

  ibidi3孔可移除腔室载玻片可对MCF-7细胞进行培养、固定和染色,为其免疫荧光实验提供一种简单且经济高效的方案。

  

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  实验使用材料:  

  此次实验所需使用的材料和试剂如下所示。此外,还需要配备一台有适当滤光片组的倒置或正置荧光显微镜。  

  

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  ·3孔可移除腔室载玻片(ibidi,80381)  

  ·3孔可移除培养专用圆形15mm盖玻片及配套工具,(ibidi,10815) 

  ·细胞:MCF-7(CLS,300273)  

  ·细胞培养基  

  ·细胞培养试剂 

  ·PBS  

  ·福尔马林中性缓冲液,10%(Sigma,HT5011) 

  ·染色试剂:DAPI(Sigma,D954)、DYE-490鬼笔环肽(Dynomics,490-33) 

  ·封片剂:FluoroshieldTM(Sigma,F6182)

  

  实验操作解决方案:细胞培养,固定,染色和成像观察--都是在一个开放型小室中搞定:  

  

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  第1步:必须在预实验中确定细胞系的正确接种浓度。根据您的细胞类型,用2-6x104细胞/ml在2-3天内产生汇合的单层。  

  1. 在无菌条件下,打开3孔可移除腔室载玻片(ibidi,80381)包装。  

  2. 像往常一样对细胞进行胰蛋白酶化和计数。MCF-7细胞浓度为3×104细胞/ml 。  

  3. 将1100μl细胞悬浮液加入腔室的每个孔中。避免摇晃,因为这会导致细胞分布不均匀。为获得更均匀的细胞分布,请使用3孔可移除培养专用圆形15mm盖玻片。  

  4. 用配套的盖子盖住。在37°C和5%CO2下培养。  

  5. 细胞至少培养24小时,或直到建立融合的单层。  

  

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  第2步:固定是染色程序的第一步。目的是将细胞、细胞结构或组织维持在当前状态,并通过化学试剂在较长时间内保存制剂。  

  1.小心地抽吸细胞培养基。  

  2.用PBS洗两次。  

  3.加入1100μl福尔马林溶液。  

  4.室温下孵育30分钟。  

  5.小心地抽吸福尔马林溶液。  

  6.用PBS洗涤三次  

  

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  第3步:应根据感兴趣的细胞结构选择染色试剂。在该方案中使用DAPI和DYE-490鬼笔环肽染色MCF-7细胞的细胞核和肌动蛋白骨架。  

  1.准备你的染色溶液:PBS、DYE-490鬼笔环肽(每单元/玻片,50 μl/单元)、DAPI 1μg/ml  

  2.小心吸出PBS。  

  3.用盖玻片拾取工具抓取15毫米的圆形盖玻片,并将其放置在腔室孔内的圆形边缘上。  

  4.将移液管-尖-端-插入其中一个角槽中,将150μl染色液移入孔中。  

  5.在室温下避光孵育30分钟  

  

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  第4步:染色后清洗样本可最大限度地减少背景信号  

  1.通过在一个角槽中添加950μl缓冲液来移除盖玻片。  

  2.用Coverslip Pick-Up Tool盖玻片拾取工具或镊子抓取漂浮的盖玻片,将其从孔中取出。  

  3.如有必要,重复洗涤步骤,抽吸缓冲液并在每孔中移液1100μl缓冲液。圆形的15毫米盖玻片无需额外的洗涤步骤。 


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  第5步:从一个边缘开始,用手或用镊子小心地取下硅胶垫圈。该步骤应以缓慢,稳定的进行,以避免损坏细胞层。

  

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  第6步:完成染色程序后,必须在用显微镜成像之前封固样品。该步骤还可防止样品脱水。  

  1.将载玻片侧面在干净的实验室湿巾上轻敲,去除样品中多余的介质。  

  2.将封固剂涂在样品上。用24 x 60毫米的盖玻片覆盖安装好的样品,小心地将盖玻片放到封片剂上,以避免夹住任何气泡。  

  Tip:建议使用硬化封片剂,如FluoroshieldTM (Sigma-Aldrich), Vectashield? (Vector Laboratories Inc.), or ProLong Antifade? (ThermoFisher Scientific)。  

  3.等封片剂固定好。


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  第7步:显微观察  

  使用可移除3孔腔室载玻片培养MCF-7细胞。用DAPI和染料490对细胞结构进行染色。圆形15mm盖玻片减少了所需的染色溶液的量。用硬化封片剂安装载玻片,可使样品长期保存。  

  

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  图1 MCF-7细胞的肌动蛋白骨架用DYE 490鬼笔肽染色(左上),细胞核用DAPI染色(右上)。下图显示了合成图像,细胞核为蓝色,肌动蛋白骨架为绿色。(比例尺:100μm)

  

  订购信息:

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