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ibidi µ-Slide VI 0.4 免疫荧光实验,四步简单操作,小白也轻松上手!

更新时间:2023-07-10   更新时间:2023-07-10   点击次数:721次

  免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。本文将介绍免疫荧光实验的新方法;此文将描述在通道载玻片内培养大鼠成纤维细胞(Rat1)的单个实验案例。然后再用AlexaFluor®488鬼笔环肽染色F-肌动蛋白细胞骨架,并用DAPI对细胞核进行复染。  

  

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  细胞免疫荧光实验包括四个主要步骤:

  

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  1、培养

  

  • 在无菌条件下打开 μ-Slide VI 0.4、ibiTreat (80606) 的包装,并将其放在 μ-Slide 架 (80003) 上。

  

  • 在每个通道中加入 30 μl 3x105细胞/ml 大鼠成纤维细胞(Rat1)细胞悬液。如下图所示或我们的网站上所示,直接将移液器加入通道。  

  

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  • 用随附的盖子盖住。

  

  • 将载玻片放入培养箱 (37 °C; 5% CO2) 培养并让细胞附着 (60 分钟)。然后用 60 μl 无细胞培养基填充两个通道口。

  

  • 孵育过夜。

  

  2、固定和透化

  

  在固定和透化过程中要小心,通道永远不要变干!通过用下一个冲洗剩余的溶液来交换通道中的液体

  

  固定:

  

  • 使用细胞培养抽吸装置从所有通道口中吸出培养基。用 Dulbecco PBS 洗涤细胞,方法是将 200 μl 缓慢加入每个通道的一个空通道口,并从每个通道的相对通道口吸出。不要吸出整个通道体积。

  

  • 用约 100 μl 3.7% 多聚甲醛的 PBS 固定细胞。20 分钟后,通过用 200 μl PBS 填充一孔并从另一孔中吸出来冲洗通道内的液体;确保通道-不干涸。

  

  透化和封闭:

  

  • 如上所述,用 200 μl PBS 再次洗涤细胞。

  

  • 在 PBS 中用 ~100 μl 0.1% Triton® X-100 3-5 分钟。

  

  • 用 PBS 洗涤细胞。

  

  • 用 ~100 μl 封闭溶液(PBS 中的 1% BSA)20 分钟。

  

  • 用 PBS 洗涤细胞。

  

  3、染色

  

  • 使用抽吸装置从通道中取出所有液体。不要让通道变干。

  

  • 吸液后立即加入 30 μl Alexa Fluor® 488 鬼笔环肽(在 200 μl PBS 和 1% BSA 中)。用 1 毫升注射器注射溶液会有所帮助。在室温下孵育 20 分钟。

  

  • 用 PBS 洗涤细胞。

  

  • 用 30 μl DAPI (0.1 μg/ml) 3-5 分钟。

  

  • 用 PBS 清洗细胞并应用 ibidi 封固培养基,直到通道被填满(约 50 μl)。ibidi 封固剂以甘油为基础,并含有用于抗褪色的 DABCO。载玻片可存放约4 周。

  

  4、成像

  

  在荧光显微镜下选择适当的滤镜,也可以使用浸油观察细胞。  

  

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  之所能如此简便完成免疫荧光实验,是因为这些ibidi培养皿和载玻片的底部为特殊处理的材质,绝大多数细胞可以直接贴壁生长,而不需要另外包被。同时,这些耗材的底部薄如盖玻片,可以直接使用倒置显微镜进行观察,得到高质量的成像,适用于显微镜比如共聚焦显微镜。

  

  实验例子:

  

  超分辨率显微镜 (STED)观察肌动蛋白细胞骨架

  

  μ-Slide VI 0.4与超分辨率显微镜方法兼容,使用 LifeAct-TagGFP2 蛋白,可以详细观察肌动蛋白细胞骨架。在这个实验中,固定的 Rat1 成纤维细胞与 LifeAct-TagGFP2 蛋白一起在 μ-Slide VI 0.4,ibiTreat中孵育。并用 STED 显微镜以创建超分辨率图像。  

  

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  使用LifeAct-TagGFP2 蛋白对 Rat1 成纤维细胞中的肌动蛋白细胞骨架进行超分辨率显微镜检查。使用 Plan-Neofluar 100x/1.4 物镜在 STEDYCON 超分辨率 STED 纳米显微镜系统(Abberior Instruments GmbH,德国哥廷根)上进行显微镜检查。

  

  μ-Slide VI 0.4用于获取人 BJ 成纤维细胞的共聚焦图像。用 Drp-1 siRNA 转染细胞并用 MitoTracker Red 染色以观察融合的线粒体。在 ibidi μ-Slide VI 0.4中培养的人 BJ 成纤维细胞的共聚焦显微镜图像。MitoTracker Red(红色)用于可视化线粒体。

  

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