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µ-Slide趋化载玻片|HUVEC的3D免疫荧光染色细胞趋化实验

更新时间:2023-11-14   更新时间:2023-11-14   点击次数:499次

  在趋化性细胞迁移后,可通过免疫细胞化学染色研究定向细胞迁移的形态学特征。ibidi µ-Slide Chemotaxis细胞趋化载玻片可对嵌入的HUVEC(人脐静脉内皮细胞)进行免疫荧光染色的详细实验方案。


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µ-Slide 细胞趋化载玻片


  一、实验材料准备:


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  二、实验步骤:

  

  将人脐静脉内皮细胞接种在百分之五十的Matrigel®中,并填充至细胞趋化载玻片中,然后将其沿百分之十的FCS梯度迁移二十四个小时。采用免疫染色法观察内皮细胞在Matrigel®中定向迁移后的形态学特征。人脐静脉内皮细胞的染色是直接在µ-Slide细胞趋化载玻片中进行的。

  

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  1) 从一边储液池中取出塞子,然后吸出培养基。在抽吸和冲洗步骤中,将塞子留在中央通道中。

  

  2) 用1x PBS洗涤

  

  3) 用百分之四的多聚甲醛固定细胞和基质蛋白

  

  4) 重复实验操作过程2的步骤

  

  5) 用百分之零点二的riton X-100 / PBS透化细胞

  

  6)  继续重复实验操作过程2的步骤

  

  7) 用百分之一的BSA/PBS阻断非特异性抗原→过夜

  

  8) 继续重复实验操作过程2的步骤

  

  9) 添加一抗:单克隆抗VE钙黏着蛋白,小鼠在四摄氏度下1x 24小时

  

  10) 继续重复实验操作过程2的步骤

  

  11) 添加二抗:山羊抗小鼠IgG,Alexa Fluor 680→在四摄氏度下过夜

  

  12) 继续重复实验操作过程2的步骤

  

  13) 加入染色混合物

  

  i) 罗丹明phalloidin染色肌动蛋白丝

  

  ii) Hoechst 33342对细胞核染色

  

  14) 继续重复实验操作过程2的步骤

  

  15) 将最后的PBS留在储液罐中并开始成像。

  

  免疫荧光图像是由共聚焦激光扫描显微镜获得,配以水物镜。

  

  重要提示:与标准染色方案相比,洗涤和染色步骤所需的培养时间更长。这是为了确保抗体通过凝胶充分扩散。

  

  三、细胞样品实验结果:

  

  人脐静脉内皮细胞在Matrigel®基质中的免疫染色显示,相邻的细胞组优先形成细胞簇并作为集合体迁移。少数细胞呈单细胞迁移。  

  

  

  图中显示人脐静脉内皮细胞百分之五十的Matrigel®中的多细胞趋化性的细胞簇。固定后,对细胞进行细胞核蓝色、F-肌动蛋白红色和VE钙粘蛋白青色等进行染色。白色箭头表示VE介导的细胞-细胞接触。

  

  当细胞作为个体迁移时,细胞体被拉长,呈间充质梭形。细胞呈前后极性,前缘呈小片状,向梯度方向有突起。当以多细胞单元组织时,细胞团簇表现出明显的前后不对称的群极化。在这里,一个或几个前导细胞参与了前缘的形成,前缘表现出细长的突起或宽的片层。迁移复合体较深区域的连续细胞没有极化。然而,这些细胞特征性地保留了VE钙粘蛋白介导的细胞-细胞接触。