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细胞趋化实验新方法:可实时观察细胞动态

更新时间:2016-04-26   更新时间:2016-04-26   点击次数:2821次

细胞趋化实验新方法:可实时观察细胞动态

细胞趋化性(Chemotaxis,亦被称为化学趋向性)是趋向性的一种,指细胞、细菌及其他单细胞、多细胞生物依据环境中某些化学物质而趋向的运动。趋化性对细胞的发展和其他正常功能一样*。

在这里,我们以小鼠树突状细胞为例,介绍一个细胞的化学趋化实验。

 

一、实验材料准备:

 

  1. 仪器:
  • 细胞培养箱(高湿度,375%CO2
  • 倒置显微镜,具有10X相差物镜和定时拍照功能
  • 镜载加热孵育系统(375%CO2
  • 可选配置:全自动载物台,自动对焦系统
  • 分析软件:可选用手动分析软ImageJ“Manual Tracking”模块,或全自动的ibidi提供的WimTaxis进行细胞轨迹追踪。后使用ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool” 进行数据统计分析。

 

  1. 树突状细胞:

实验前一天准备工作:

为了减少ibidi细胞趋化载玻片与培养基中的气泡,将载玻片和培养基提前24小时放入培养箱中

8-10天的树突状细胞用200 ng/ml LPS 过一个晚上处理(培养基等试剂见表一)

表一:细胞培养和活化所需的试剂盒培养基

*Lutz, M. B. et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods 223, 77–92 (1999)  

  1. 基质胶制备,Collagen Ibovine1.6mg/ml

树突状细胞的化学趋化实验所需的试剂如下:

                                         表二:化学趋化需要的耗材和试剂

 

表三:制备1.6mg/ml 基质胶

操作步骤:
●使用表一中的培养基制备  9 x 106 cells/ml 的细胞悬液
●在1.5ml离心管中小心混匀表三中的1和2号试剂,避免产生气泡
●在另一1.5ml离心管中准备150 μl  collagen 
●使用200μl枪头从第二步的混合液中吸取30μl(图一A)
●小心混匀(图一B),避免产生气泡
●加入90μl细胞悬液到上一步混合液中(图一C)
●小心混匀(图一D),避免产生气泡

图一:制备细胞-基质胶混合液图示,注意:1)避免产生气泡,气泡会破坏胶原纤维,不能使用Vortex2)胶原混合后,离胶凝大约有5分钟时间,如果在凝胶后再进行操作会破坏胶原纤维;3)当刚加10x MEMNaHCO3中的时候会看到颜色变化,这表明没有充分反应,因此加入混合液到胶原蛋白中后要充分混匀。

 

  1. 细胞趋化实验

 

  1. 趋化试剂
  • 化学趋化物:CCL 191.25 μg/ml in RPMI 1640/10%FCS
  • 无化学趋化物培养基:RPMI164010%FCS

 

  1. 实验步骤

 

  • 当细胞-基质胶混合液制备好后直接加入ibidi细胞趋化载玻片的中间通道中(图二)

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图二,在观测通道中加入细胞-基质胶混合液

  • 将细胞趋化载玻片放入培养箱中30-35分钟,等待胶原蛋白凝固

胶凝固后,分别在两边储液池中加入60μl的化学趋化物和无化学趋化物培养基作为细胞趋化实验(+/-)(图三)

 

图三:加入化学趋化物(红色)和无化学趋化物培养基(蓝色)

在两边储液池中均加入60μl的无化学趋化物培养基作为空白对照(-/-)(图四

 

图四:加入无化学趋化物培养基(蓝色)作为空白对照

 

  • 按说明,将通道加液孔塞紧后可以进行图像采集
  • 将载玻片置入镜载加热孵育系统中,调整好采集位点,进行4小时的观测,每2分钟采集一张图片

 

图五:明场1小时处图像采集,由于是3D培养环境,不是所有的细胞都能被清楚的成像。

 

  1. 图像处理
  1. 手动细胞轨迹追踪
  • 下载ImageJ,并安装Manual Tracking模块
  • 导入采集的系列图像到ImageJ中,打开模块“Manual Tracking”,选择“Add track”开始记录细胞轨迹
  • 选择一个细胞,按照时间点单击细胞,*点击后,会有新窗口跳出来显示初始位置,以后每次点击,都将在这个新窗口中产生一个该细胞随着时间的新坐标
  • 统计完足够的细胞轨迹后,保存轨迹坐标表格
  • 至少收集30个细胞的轨迹才具有统计学意义,避免同一细胞追踪两次,去除由于凋亡会而不能采集完整的轨迹的细胞
  • 可以将“Overlay dots & lines”.avi格式导出

 

2)全自动细胞轨迹追踪

使用ibidiWimTaxis自动分析平台,将采集的系列图像上传到该平台,几个工作日后,会得到细胞轨迹的坐标表格数据结果。

 

四、数据处理

 

使用迁移指数( Forward Migration Indices*FMIs)作为比较趋化实验和对照试验的参数。在有趋化物的情况下,空白对照的FMI和与趋化物垂直方向的化学趋化的迁移指数(FMI)应是在0点左右。而与趋化物平行方向的化学趋化的迁移指数(FMI‖)与0点有显著的区别表现出了化学趋向性。同时,使用Rayleigh Test**对细胞趋化的方向性进行检验。如果p值大于0.05表示了细胞运动的无序性,表明没有方向性的迁移。此外,迁移速率等参数也能直接用于分析。

*Foxman et al. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation, J Cell Biol 147, 577-588 (1999)  

**Fisher, N. I. Statistical Analysis of Circular Data, Cambridge University Press, New York (1993) 

 

五、统计结果:

实验优势总结

1.可实时观察细胞趋化情况;

2.可计算细胞的趋化速率;

3.在1组实验中即可做出连续性趋化浓度梯度;

4.建立的浓度梯度可维持长达48小时,对快速迁移细胞或慢速迁移细胞都适用;

5.可选配套的图像分析,轻松得到实验数据。