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分光光度法测定叶酸的方法

更新时间:2013-06-28 更新时间:2013-06-28   点击次数:2546次

 微生物法

1.原理
叶酸是酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei, L. C, ATCC 7469)生长所必需的营养素。在一定条件下,L.C的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系,细菌增殖的量以光密度值计,通过与标准曲线相比较,计算出样品中叶酸的含量。
2.适用范围
参考《Methods of Vitamin Assay》,第4版。本方法适用于各类食物中叶酸的测定。检测限为0.1ng。
3.仪器与设备
(1) 恒温培养箱
(2) 离心机
(3) 高压消毒锅
(4) 震荡器
(5) 接种针和接种环
(6) 分光光度计
4.试剂
除特殊说明外,本实验中所有试剂均为分析纯,水为蒸馏水。
(1) 菌种:酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei, L.C, ATCC 7469)
(2) 磷酸缓冲液(0.05mol/L, pH6.8):称取4.35g Na3PO4·12H2O,10.39g Na2HPO4·7H2O溶解于800ml水中。临用前用约5g抗坏血酸调节pH至6.8。(注:叶酸对光、热敏感,易被氧化破坏,抗坏血酸有助于保护叶酸被氧化。)
(3) 鸡胰酶溶液: 称取100mg干燥的鸡胰酶(Difco公司)(注:含有叶酸轭合酶,用于水解叶酸多谷氨酸盐), 加入20ml磷酸缓冲液制成匀浆,3000rpm离心10min,取上清液备用。临用前现配。
(4) 蛋白酶-淀粉酶溶液:分别称取200mg蛋白酶(Sigma公司)和淀粉酶(Sigma公司),加入20ml磷酸缓冲液制成匀浆,离心3000rpm 10min,取上清液备用。临用前配制。
(5) 2+8乙醇溶液:量取20ml无水乙醇溶液,加入80ml水混匀。
(6) 01mol/L NaOH: 称取0.4g氢氧化钠,加2+8乙醇溶液溶解并稀释至1L。
(7) 10mol/L NaOH。称取400g氢氧化钠,加水溶解并稀释至1L。
(8) 叶酸标准储备液(200mg/ml):准确称取200mg叶酸标准品(Sigma公司,纯度大于98%),用0.01mol/L NaOH溶解并定容至1L。储存于棕色瓶中。
(9) 叶酸标准中间液(200ng/ml):准确吸取1.0ml叶酸标准储备液,用0.01mol/L NaOH 溶解并定容至1L。储存于棕色瓶中。待标定。
标定:准确吸取1ml叶酸标准中间液,用0.1mol/L NaOH定容至10ml。以0.1mol/L NaOH调零点,比色杯厚度1cm,波长256nm,测定3次紫外吸光度值,取平均值,按下式计算标准中间液浓度。

X1 = `A ×M ×10×106 …………………(1)
E

式中:
X1 -- 叶酸标准中间液浓度,ng/ml;
A -- 标准中间液平均紫外吸光度值;
E -- 摩尔消光系数24,500;
M -- 叶酸分子量441.42;
10-- 测定紫外吸光度值时的稀释倍数;
106 -- 由g/L换算成ng/ml的换算系数。
(10) 叶酸标准工作液(0.2ng/ml):准确吸取1.0ml叶酸标准中间液,用磷酸缓冲液稀释定容至1L。
(11) 2.4mol/L HCl:量取20ml浓盐酸,加水稀释至100ml。
(12) 酶解酪蛋白溶液:将8g碳酸氢钠溶解于1L水中,加入60g去维生素酪蛋白(Sigma 公司),用10mol/L NaOH调节pH至 8.0(调pH时应小心,不要过碱后再加酸反复调节,避免酪蛋白结块)。加入300mg胰酶,搅拌20min,使胰酶混匀充分。再加入2.5ml甲苯,置37℃恒温箱酶解48~72h(此步骤是将酪蛋白酶解为L.C可以利用的小分子肽。酶解时间不易超过72h,如时间过长,配成的培养基不利于细菌生长)。将酪蛋白液从恒温箱中取出,121℃高压30min以终止反应并去除甲苯。冷却,加10g硅藻土搅拌,用垫有滤纸的布氏漏斗过滤。向滤液中加入约60ml冰乙酸调节pH至3.7。称取活性炭12g,加入滤液中搅拌10min,用布氏漏斗过滤,重复三次。每次过滤时,布氏漏斗内加有10g硅藻土协助过滤。后滤液用水稀释至1200ml,4℃冰箱保存1年(活性碳可吸附酪蛋白中的叶酸以减少试剂空白,同时也可吸附肽及氨基酸,应注意控制搅拌时间)。取10ml酶解后的酪蛋白溶液加入已称重的蒸发皿中,沸水浴蒸发至干。将蒸发皿置于100℃恒温烤箱内干燥至恒重,在干燥器中冷却至室温。称量蒸发皿的重量,蒸发皿内固体重量,如固体重量小于400mg,即每毫升酪蛋白溶液中固体含量<40mg,则弃除酪蛋白液,重新制备。
(13) 黄嘌呤溶液:取0.4g黄嘌呤,加入10ml氨水,加热溶解,用水稀释至100ml。冰箱保存。
(14) 腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶:分别称取硫酸腺嘌呤,盐酸鸟嘌呤和尿嘧啶各0.2g,加入2.4 mol/L HCl溶液10 ml,加热溶解,用水稀释至100ml,室温贮存。
(15) 乙酸缓冲液(1.7mol/L,pH4.5):38.65g无水乙酸钠,19.8ml冰乙酸,加水稀释至500ml。
(16) 维生素溶液:取10mg核黄素溶解于40 ml乙酸缓冲液中。取0.2mg生物素,2.5mg NaHCO3,20mg对氨基苯甲酸,40mg盐酸吡多醇,4mg盐酸硫胺素,8mg泛酸钙,8mg尼克酸溶解于50ml水中。将上述两种溶液混合,加水至100ml。
(17) 吐温-80溶液:将2g吐温-80加入100ml 45℃水中,混匀。
(18) 还原型谷胱甘肽溶液:取0.1g还原型谷胱甘肽,加水至100ml.
(19) 甲盐溶液:称取5g磷酸氢二钾和2g磷酸二氢钾,加水溶解至100ml,液面上加入少许甲苯保存。
(20) 乙盐溶液:称取2 g硫酸镁,0.5 g硫酸亚铁和0.5 g硫酸锰,加水至100 ml,液面上加少许甲苯保存。
(21) 基础培养基:按下表配制,终定容至500ml。

酶解酪蛋白 100ml L-盐酸半胱氨酸 0.2 g
腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶 2.5 ml 色氨酸 0.2 g
黄嘌呤溶液 2.5 ml 还原型谷胱甘肽溶液 2.5ml
维生素溶液 5ml 葡萄糖 20 g
吐温-80溶液 2.5 ml 乙酸钠 20 g
L-天冬氨酸 0.3 g 甲盐溶液 2.5 ml

加水至250 ml,搅拌,用10mol/LnaOH溶液调节pH 6.8±0.1,然后加入乙盐溶液2.5 ml,磷酸缓冲液200 ml,用水补至500 ml。4℃冰箱内可保存一周 。
(甲、乙盐混合后易产生沉淀,所以配培养基时不可同时加入,加入甲盐后先调节pH再加入乙盐。基础培养基也可直接选购DIFCO公司生产的叶酸测定用培养基)
(22) 琼脂培养基:

葡萄糖 1 g 甲盐溶液 0.2 ml
蛋白胨 0.8 g 乙盐溶液 0.2 ml
酵母提取物干粉 0.2 g 琼脂 1.2g
乙酸钠(NaAc·3H2O) 1.7 g    

加水至100 ml,置水浴煮至琼脂熔化,调节pH 6.8±0.1。尽快倒入试管中,每管3~5 ml,塞上棉塞,121℃高压灭菌15 min,取出后直立试管,冷却至室温.于冰箱内保存。
5.菌种制备与保存
(1) 储备菌种的制备:将L.C纯菌种转接至2个或多个琼脂培养基管中。37 ℃±0.5 ℃恒温培养箱中培养16~24 h。贮于冰箱内,每周转种一次留作储备菌种。
(2) 种子培养液的制备:取2 ml叶酸标准使用液和10 ml基础培养基,混匀,分装至4支5 ml离心管中,塞上棉塞,121℃高压灭菌15 min,实验时现制。
6.操作步骤
所有操作均需避光进行
6.1 样品制备
(1) 强化剂型样品:称取0.1~0.5 g样品(约含叶酸100~300 ng)于100 ml锥形瓶中,加入50 ml磷酸缓冲液,混匀。121℃高压水解15 min。定容至100ml,过滤。
(2) 果蔬类:称取样品0.2~2 g(约含叶酸100~300 ng),加磷酸缓冲液经高压水解后过滤,残渣用同样缓冲液再次高压,过滤。合并两次滤液,定容至100ml。
(3) 谷、肉、蛋、鱼、豆、奶类等富含淀粉和/或蛋白类样品:称取样品0.1-2 g(约含叶酸100~300 ng),加磷酸缓冲液高压水解后, 冷却。加入1 ml鸡胰酶和1 ml蛋白酶-淀粉酶液,1 ml甲苯,充分混合,置于37 ℃±0.5 ℃恒温箱内酶解16~20h。酶解后定容至100ml过滤。另取一支试管,加入1 ml鸡胰酶,1 ml蛋白酶-淀粉酶和磷酸缓冲液,作酶空白。
(4) 口服液、饮料、果汁等样品:称取样品0.5~2 ml(约含叶酸100~300 ng),加磷酸缓冲液高压水解后, 冷却,加入1ml鸡胰酶,1 ml甲苯,充分混合,置于37 ℃±0.5 ℃恒温箱内酶解16~20 h。酶解后定容至100ml,过滤。另取一支试管,加入1 ml鸡胰酶和磷酸缓冲液,作酶空白。
6.2根据样品叶酸含量,将上述滤液用磷酸缓冲液稀释到一定倍数,使叶酸终浓度为0.1~0.4 ng/ml。
6.3样品管的制备:取4支试管,每支试管中分别加入稀释后样品液1.0、2.0、3.0、4.0 ml,补充水至体积为5.0 ml,加入5 ml基础培养基,混匀。同样制作酶空白管。
6.4 灭菌:将以上标准系列管、样品管和酶空白管全部塞上棉塞,121℃高压灭菌15 min。
6.5 标准系列管的制备:取试管分别加入叶酸标准工作液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml,相当于叶酸含量0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 ng,加水补至体积为5.0 ml,再加5 ml基础培养基,混匀。如样品管一样进行灭菌。标准系列管进行平行测定。
6.6 接种
(1) 接种液的制备:接种前一天,用灭菌的接种针将菌种由储备菌种管中转种至2支已灭菌的种子培养液中,37℃±0.5℃恒温培养箱中培养16~24 h。混悬种子培养液,无菌操作下用接种针管将20滴种子培养液转移至另2支无菌的种子培养液中,37 ℃±0.5 ℃再培养6h。震荡混匀,制成菌种混悬液。立即使用。(叶酸是L.C生长所必需的,但是如果培养基中叶酸含量过高,细菌可在体内贮存,使测定空白值,影响细菌生长曲线。将接种液转种再培养6h,有利于消耗细菌体内贮存的叶酸。)
(2) 接种:在无菌操作条件下向每支已灭菌的标准系列管、样品管和酶空白管接种一滴上述接种液(注意应直接滴在培养基内),混匀。留一支标准0管不接种,用于测定光密度时调零。
6.7 培养:置于37 ℃±0.5 ℃恒温培养箱中培养20~40 h。
6.8 测定:用分光光度计,在波长540 nm下,以未接种的标准0管调节零点,测定标准管、样品管和酶空白管的光密度值。
7.计算
(1) 绘制标准曲线:以标准系列管中叶酸含量为横坐标,光密度值为纵坐标,绘制叶酸标准曲线。
(2) 结果计算:根据样品管和酶空白管的光密度值,从标准曲线上查得相应的叶酸含量,按下式计算。

= -P)×V1×F × 100
× V 2 1000

式中:
X--样品中叶酸含量,μg/100g;
c--从标准曲线上查得样品测定管中叶酸含量,ng;
P--从标准曲线上查得酶空白管中叶酸含量,ng;
V1--样品制备时定容体积,ml;
F--稀释倍数;
V2--制备样品测定管时加入的样品液体积,ml;
m--样品质量,g;
100/1000──样品含量由ng/g换算成μg/100g的系数。
8.注意事项
(1) 同一实验室平行测定或重复测定结果相对偏差值<10%。
(2) 微生物法的测定结果为总叶酸含量。
(3) 微生物法测定叶酸常用的菌种除L.C外还有粪链球菌(Streptococcus faecalis, S.F. ATCC 8043)。用L.C测定灵敏度高,用S.F.测定重现性好。本方法选用L.C,实验条件以适宜酪乳酸杆菌的生长条件而定。
(4) 常用的酪蛋白处理方法有酶水解法、酸水解法和碱水解法,由于叶酸在碱性条件下相对稳定,所以用碱处理酪蛋白不能破坏叶酸,使培养基中叶酸含量偏高,标准空白值高,线性差。酸水解法和酶水解法均可有效去除叶酸,降解蛋白,使细菌生长曲线在0~1ng范围内线性良好,其中实验证明酶水解法更好。
(5) 培养基的pH对细菌生长很重要,pH6.8~7.2,生长曲线佳。PH过低或过高均不利于细菌生长。
(6) 本方法配制的培养基和Difico公司的叶酸培养基比较,标准曲线线性基本一致,对样品检测结果基本一致。
(7) 食物中叶酸多以多谷氨酸盐形式存在,而L.C只能利用叶酸单、双、三谷氨酸盐,所以对天然食品处理时先用轭合酶对叶酸进行降解。常用的轭合酶来源有血浆、鸡胰酶和猪肾酶。猪肾酶需从市售猪肾中提取,操作复杂,提取后对酶的坚定相对困难,且重复性差,酶的用量难于控制。鸡胰酶可从Difco公司购买,可直接使用,重复性好。鸡胰酶的用量与叶酸测定结果相关,以往报告中认为水解200ng叶酸需加入0.5~1mg鸡胰酶。也有人认为在pH7.0的环境下增加酶的用量可提高叶酸水解率。本实验室认为水解200 ng 叶酸,鸡胰酶用量宜控制在3~5mg左右,过高可降低水解效果。
(8) 轭合酶在应用中也有其局限性。天然食物中往往也含有轭合酶,在食物贮藏、运输过程中叶酸衍生物之间可发生相互转化,使外源性轭合酶作用下降;并且蔬菜水果存在一些酶的干扰物质也影响酶的活性,如柠檬酸、鞣酸等。所以测定中样品需注意保鲜,及时测定;样品处理方法也应视样品性质而定。
(9) 蛋白酶、淀粉酶的应用可将包裹于蛋白、淀粉之间或与蛋白结合的叶酸释放,有助于样品检测。蛋白酶、淀粉酶、鸡胰酶联合应用,水解效力大于3酶效力之和。