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ibidi实验方案|在流体环境下细胞培养进行粘附实验

更新时间:2022-08-09   更新时间:2022-08-09   点击次数:948次

  在流体环境下细胞培养进行粘附实验,该应用描述了一种在流动下的粘附试验,该试验旨在研究特定细胞表面分子的作用,以确定它们在细胞附着和粘附到其他细胞类型期间的潜在相互作用。


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  实验流程  

  1.准备EOMA细胞稀释液:根据制造商的说明,使用非酶细胞解离溶液分离先前培养的EOMA细胞。使用血细胞计数器(Neubauerchamber)对细胞进行计数。在EC培养基中将细胞稀释至1.2x106个细胞/ml的浓度。  


  2.种入EOMA细胞:在3个 µ-SlidesI0.6mmLuer(ibidi,80186)中加入150µlEOMA细胞稀释液(每个µ-Slide1.75x105EOMA细胞),然后孵育3小时。


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  表1:实验设置

  

  3.启动流量:播种三小时后,将2个µ-Slides连接到流体单元FU,使用总量2.7毫升EC培养基。在8.2mbar的压力下将EOMA细胞表面的剪切应力设置为0.5dyn/cm²。测量流速并使用两个FU的平均值来计算校准因子。提前孵育FU和连接的载玻片过夜。第三个带有EOMA细胞的µ-Slide用作静态控制。在没有任何流动的情况下孵育它过夜。

  

  4.准备MM细胞:根据制造商的方案,用CellTrackerGreen(CMFDA)染料在600µlRPMI培养基(不含FCS)中染色6x105MM细胞。标记后,离心细胞并使用血细胞计数器对其进行计数。

  

  5.开始与MM细胞共培养:停止流动并在无菌条件下从FU水库中取出EC培养基。要开始共培养,将RPMI培养基(含10%FCS)和EC培养基以1:1的比例混合,并填充该混合物总体积为2.5ml,其中含有1.5x105MM注入两个FU储液罐。将FU重新连接到泵系统并继续流动24小时。

  

  6.分子阻断:将MM细胞添加到ECs后24小时,用100µg/ml抗体(载玻片 #2)或相应的同种型对照(载玻片 #1)处理细胞,将它们直接添加到FU,无需更换介质。将孵育保持在流动状态下24小时。

  

  7.清洗和成像:从FU上断开µ-Slides。用PBS清洗细胞一次,以去除任何非贴壁细胞。使用共聚焦显微镜获取荧光图像,以可视化附着在EC层上的标记MM细胞。

  

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  图1:与同种型对照处理(左图)相比,阻断特定表面分子(右图)时,MM细胞对ECs的粘附性降低