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活细胞骨架染色中的应用

更新时间:2016-06-06   更新时间:2016-06-06   点击次数:2934次

Actin-肌动蛋白是细胞骨架*的一个组成部分,其在很多基础的细胞活动中扮演着非常重要的角色。尤其在细胞形态,迁移和研究细胞机制中,肌动蛋白都是一个非常理想的观测蛋白。肌动蛋白是由小球状的G-actin聚合成丝状的F-actin动态交互变化构成的,从而参与了细胞活动中的各种细胞骨架的变化。通常研究活细胞中actin的活动用的是转染actin-GFP融合蛋白的质粒,可以同时标记F-actin和G-actin,可以有效的反映出细胞骨架的相对活性,但是当值需要观测F-actin的时候,使用actin-GFP会降低信噪比,难以专一捕捉F-actin的活动。更有研究显示,使用actin-GFP会直接影响细胞迁移和细胞分裂中的肌动蛋白活性。

 

2015年英国的科研人员研究了几种可以标记F-actin染料发现LifeAct是一种观测F-actin非常理想的染料,其能特异性结合F-actin而不会影响肌动蛋白的活性,能够很好的显现出肌动蛋白的结构。LifeAct是一个17个氨基酸形成短肽,由于其很小,不会被哺乳动物细胞当作外来蛋白清除,从而使一个非常理想的F-actin标记物。文中,以人间充质干细胞(hMSCs, Human mesenchymal stem cells)为载体,研究LifeAct-GFP对比actin-GFP在观测肌动蛋白中的应用。

 

Differential effects of LifeAct-GFP and actin-GFP on cell mechanics assessed using micropipette aspiration

K. Sliogeryte, S. Thorpe, Z. Wang, C. Thompson, N. Gavara and M. Knight

Journal of Biomechanics, 2015, 10.1016/j.jbiomech.2015.12.034

 

 

(一)实验材料

  • 细胞:     hMSCs            (STEMCELL Technologies,UK)
  • 试剂:    LifeAct-TagGFP2 质粒    (ibidi, Germany)

             DMEM             (Gibco)

             Actin-GFP

             Lipofetamine LTX Plus     (Invitrogen)

             4%多聚甲醛溶液

             0.5%Triton X-100

  3) 耗材:玻璃管(外径1mm,内径0.58mm)

 

(二)实验步骤

  1、LifeAct-GFP和 actin-GFP转染

  • 使用未分化的hMSCs细胞转染actin-GFP质粒。
  • 无抗生素10%FBS低葡萄糖DMEM培养细胞30min到1h
  • 使用Lipofetamine LTX Plus转染质粒,按照说明书将细胞在转染培养基中培养6小时。
  • 使用未分化的hMSCs细胞和,hMSCs细胞分化的永生化软骨细胞系感染含LifeAct-TagGFP2的腺病毒。

 

2、固定细胞的肌动蛋白结构

使用Alexa Flour555-phalloidin标记F-actin

  • 单层细胞贴壁染色,是将已经用LifeAct-GFP和 actin-GFP转染的细胞,用4%多聚甲醛固定10分钟,再用0.5%Triton X-100通透5分钟,再用Alexa Flour555-phalloidin染色20分钟。
  • 悬浮细胞染色,是将已经用LifeAct-GFP和 actin-GFP转染的细胞消化为单细胞,再在悬浮液中直接用4%多聚甲醛固定10分钟,再用0.5%Triton X-100通透5分钟,再用Alexa Flour555-phalloidin染色20分钟。

 

3、微管吸吮技术

  • 将外径1mm,内径0.58mm玻璃管拉为内径7-8μm的微管
  • 使用注射泵维持微管内有0.76kPa的负压
  • 轻轻吸取细胞,每2秒采集一张图片
  • 细胞在微管负压情况下会有不规则的突起,进入微管,能很好的观测F-actin的活动。

 

 

  • 实验结果

 

1、鬼笔环肽和LifeAct-GFP和 actin-GFP转染共定位(图一)

图一:鬼笔环肽和LifeAct-GFP和 actin-GFP转染共定位:A、E)贴壁细胞中,LifeAct-GFP和 Actin-GFP 在标记F-actin时都表现很好,但是在悬浮细胞中,C、G)虽然LifeAct-GFP和 Actin-GFP和鬼笔环肽都能共定位F-actin,但是actin-GFP在整个细胞中都有染色,因为其同时染G-actin没有凸显出F-actin。

 

2、微管吸吮技术使细胞发生形变,观察F-actin活动(图二)

 

图二:微管吸吮技术造成细胞形变。A)LifeAct-GFP可以很好的追踪F-actin,会根据细胞的形变,标记到细胞突起的外缘的骨架;B)使用Actin-GFP标记没有特异性,不能看到细胞变形中边缘的骨架。